1　前言 　　

染料分子结构中，凡是含有偶氮基(-N=N-)的统称为偶氮染料[1]。自1856年英国有机化学家Perkin合成出苯胺紫后，偶氮染料的新品种不断出现，逐渐居于染料市场主导地位[2]。然而偶氮染料通常含有复杂的芳香环结构，化学稳定性高、可降解性低，且多数偶氮染料及其代谢产物具有致突变性、致癌性和其他毒性，因此偶氮染料废水成为重要的环境污染物[3]。目前，传统的染料废水处理方法主要包括物理法及化学法。然而，传统方法往往具有能耗大、脱色率低及容易造成二次污染等局限性，因而尚未广泛应用于染料废水的处理[4]。自20世纪70年代末发现某些肠道细菌可降解偶氮染料以来，越来越多的学者致力于偶氮染料的微生物脱色研究。目前已分离到的偶氮脱色菌株主要包括芽孢杆菌、黄单胞菌、克雷伯氏菌等十几个菌属[5]。纵观国内外学者的研究结果，虽然已发现的偶氮染料降解菌株越来越多，但仍缺少高效广谱的偶氮染料降解菌，因此从环境中分离并鉴定出高效的偶氮降解菌依然是日后在环境染料污染治理方面的主要研究方向之一。 　　本研究目的是从受印染废水长期污染的土样中驯化分离出一株对偶氮染料刚果红具有较强的降解能力的细菌，从形态观察、生理生化特性以及16S rDNA序列分析三个方面对菌株进行鉴定，确定其所属种属;同时对该菌的降解培养基进行初步优化，以提高刚果红的降解率。 　　

2　材料与方法 　　

2.1　生化试剂 　　

CTAB、EDTA以及SDS均购自Sigma公司;dNTPs(10 mmol/L)、Taq DNA polymerase(5.0 U/μl)、pMD-18T质粒、Escherichia coli JM109大肠杆菌感受态均购自TaKaRa公司;刚果红购自天津光复精细化工研究所;其它试剂均为国产分析纯。 　　

2.2　菌株的分离及鉴定 　　

2.2.1　刚果红降解菌株筛选 　　

(1)称取土样约2.2 g，放入装满灭菌蒸馏水的50 ml血清瓶中，加入6-8颗玻璃珠于37℃ 120 r/min振荡3 h，使土样与灭菌水充分混合，将震荡后的悬浊液静置1 h，使颗粒物沉淀。上清液即为供接种的环境样品。 　　

(2)将2 ml上清液接种至装有100 ml LB培养基的血清瓶中，37℃厌氧培养24 h。采用相同方法接种第一代培养菌液2ml至新鲜的LB培养基中进行厌氧培养，使样品中的混合菌群得到富集和活化。 　　

(3)将上述混合菌群按1/100接种量接入含有50 mg/L的刚果红的LB培养基中中进行定向筛选。采用此方法对混合菌液连续筛选培养5代，观察刚果红降解效果。 　　

(4)将筛选至第5代的混合菌群在固体筛选培养基(刚果红浓度为100 mg/L)上进行浓度梯度稀释划线分离，且对长出的单菌落进行划线纯化培养，最终纯化出一株较好的刚果红高效降解菌。 　　

2.2.2　菌株的生物学鉴定 　　

(1)形态学观察及生理生化鉴定 　　

染色及相关的生理生化鉴定方法均参照《伯杰氏细菌鉴定手册》的相关方法进行[6]。 　　

(2)16S rDNA序列分析 　　细菌基因组的提取采用CTAB法[7]。16S rDNA基因采用引物27f/1492r进行扩增。PCR程序如下：94预变性3min;94°C变性30 s,56°C退火30 s,72°C延伸90 s,30个循环;72°C延伸10 min。PCR产物经纯化后克隆至T质粒中并测序。序列应用DNA Star软件进行分析。 　　

2.2.3　菌体的生长曲线及刚果红降解曲线测定 　　

将菌液按2%接种到液体筛选培养基(刚果红浓度50 mg/L)中，37℃于厌氧箱内培养，每2 h取样测菌体在600 nm处的吸光值以确定菌体浓度。每两小时取2 ml培养液离心后在500 nm处测刚果红剩余吸光值，以含有50 mg/ L 的筛选培养基作为空白对照，并计算出降解率。 　　

2.2.4　降解条件优化 　　

2.2.4.1　降解最适碳源测定 　　

在血清瓶中分别装入75 ml碳源为葡萄糖、果糖、甘露醇、山梨醇、蔗糖、麦芽糖、乳糖、可溶性淀粉的液体筛选培养基，按2%种量接入菌液，置37℃，厌氧箱内培养24 h后取2 ml菌液离心后在500 nm处测刚果红剩余吸光值，并计算出降解率。 　　

2.2.4.2　降解最适碳源投加量测定 　　

在血清瓶中分别装入75 m1碳源为葡萄糖投加量为2 g/L、4 g/L、6 g/L、8 g/L、10 g/L、12 g/L、14 g/L、16 g/L、18 g/L、20 g/L的液体筛选培养基，按2%种量接入菌液，置37℃，厌氧箱内培养24 h后取2 ml菌液离心后在500 nm处测刚果红剩余吸光值，并计算出降解率。 　　

2.2.4.3　降解最适氮源测定 　　

在血清瓶中分别装入75 m1 氮源为硫酸铵、氯化铵、磷酸二氢铵、硝酸钾、尿素、大豆蛋白胨、酵母膏、牛肉膏的液体筛选培养基，按2%种量接入菌液，置37℃，厌氧箱内培养24 h后取2 ml菌液离心后在500 nm处测刚果红剩余吸光值，并计算出降解率。 　　

2.2.4.4　降解最适氮源投加量测定 　　

在血清瓶中分别装入75 ml 氮源为硫酸铵投加量为1 g/L、3 g/L、5 g/L、7 g/L、9 g/L、11 g/L、13 g/L的液体筛选培养基，按2%种量接入菌液，置37℃，厌氧箱内培养24 h后取2 ml菌液离心后在500 nm处测刚果红剩余吸光值，并计算出降解率。 　　

3　结果与分析 　　

3.1　降解菌株的筛选结果 　　

经过对环境样品中菌群的富集和5次筛选培养基筛选，发现含有染料刚果红的培养基能够明显脱色。对筛选第5代的混合菌群进行反复划线分离后选取一株能够在厌氧条件下降解刚果红效果最好的菌株进行后续研究，并将该菌标记为Y12。图1所示为菌株Y12在厌氧条件下划线于含有100 mg/L的筛选培养基上，经48 h培养后可以观察到平板上长有菌体的区域已逐步变为无色至透明，表明菌株Y12可以有效的利用刚果红，使其降解。图1　菌株Y12对刚果红的降解结果 　　

3.2　形态学鉴定 　　

(1)简单染色及革兰氏染色 　　

将菌株Y12进行简单染色后，于显微镜下观察的结果如图2-(A)，从图中可以看出，菌株Y12的形态为短杆状。经革兰氏染色观察到该分离菌为革兰氏阴性短杆菌(图2-B)。经过简单染色和革兰氏染色初步断定该菌为革兰氏阴性杆菌。(A)简单染色;(B)革兰氏染色图2　菌株Y12的染色结果 　　

3.3　生理生化试验结果 　　

生理生化鉴定结果如表1，经生理生化试验初步鉴定，该菌为产酸产气的革兰氏阴性杆菌，不能以明胶为碳源，不产生吲哚，没有苯丙氨酸脱氨酶。表1　细菌生理生化特征 　　

3.4　16S rDNA序列分析 　　

该菌株的16S rDNA测序结果表明该片段有1503bp。将获得的序列在GenBank中使用Blast软件进行同源性分析，结果表明该序列与Klebsiella pneumoniae strain sks1 HM007813的16SrDNA序列的同源性高达99.4%。再将获得的序列与克雷伯氏菌属内及产气肠杆菌科内相关菌株的16SrDNA用DNA Star软件的Multiple sequence Aligment程序，选用Clustal W法进行多序列比对分析，然后采用邻近法构建系统发育树(图3)，结果表明该菌在系统发育树上与Klebsiella pneumoniae聚为一支。基于此本研究认为，菌株Y12属于克雷伯氏菌属。图3　用近邻法构建的系统发育树 　　

3.5　菌株Y12生长曲线及降解曲线的测定 　　

由图4-(A)可以看出，菌株在筛选培养基中的生长呈S型曲线，在度过短暂的适应期后，菌体在第2-14 h达到对数生长期，菌体在期间快速生长，18 h后达到顶峰，菌体浓度不再增长，基本呈现稳定，菌体生长进入平台期，此时菌体的最大OD值达0.603。由图4-(b)可以看出，刚果红在0-6 h内降解比较缓慢，这是因为在该时期内培养基中的菌体浓度较低，因此无法对刚果红进行有效降解。在6-16 h，随着培养基中菌体浓度的快速升高，刚果红降解速度明显加快，在第16 h时，刚果红的降解率达到了最大值，为78%。16 h之后刚果红不再显现明显降解，这可能与培养基成分及培养基中营养物质的耗尽有关。图4　(A)菌株Y12的生长曲线;(B)刚果红的降解曲线 　　3.6　降解条件优化结果 　　

3.6.1　最适碳源优化结果 　　

分别加入等量不同碳源(2 g/L),37℃厌氧箱内培养24 h后取菌液10000 r/min离心5 min后在500 nm处测刚果红剩余吸光值，计算出的降解率如表2所示。结果显示，用葡萄糖做碳源刚果红的降解率为82%，降解效果最好，因此确定葡萄糖为该降解菌的最适碳源。表2　碳源种类的优化结果 　　

3.6.2　最适碳源投加量优化结果 　　

依次加入浓度为2 g/L、4 g/L、6 g/L、8 g/L、10 g/L、12 g/L、14 g/L、16 g/L、18 g/L、20 g/L的葡萄糖，37℃厌氧箱内培养24 h后取菌液10000 r/min离心5 min后在500 nm处测刚果红剩余吸光值，并计算出不同葡萄糖加入量的刚果红降解率如表3所示。发现，当葡萄糖浓度为8 g/L，刚果红的降解率为87%，降解效果最好，确定8 g/L的葡萄糖为该菌的降解最适碳源。而且由表中还可发现，在葡萄糖浓度达8 g/L后，再加大浓度，菌液的降解率也不再有明显变化，说明该浓度为此刚果红降解菌的最大利用碳源量。表3　碳源投加量的优化结果 　　

3.6.3　最适氮源优化结果 　　

分别加入等量不同氮源，37℃厌氧箱内培养24 h后取菌液10000 r/min离心5 min后在500 nm处测刚果红剩余吸光值，计算出的降解率如表4所示，发现用硫酸铵做氮源刚果红的降解率为91%，降解效果最好，确定硫酸铵为该降解菌的最适氮源。表4　氮源种类的优化结果 　　

3.6.4　最适氮源投加量优化结果 　　

分别加入1 g/L、3 g/L、5 g/L、7 g/L、9 g/L、11 g/L、13 g/L的硫酸铵，37℃厌氧箱内培养24 h后取菌液10000 r/min离心5 min后在500 nm处测刚果红剩余吸光值，计算出的降解率见表5。发现当硫酸铵的浓度为5 g/L时，刚果红的降解率为93%，降解效果最好，因此定5 g/L的硫酸铵为最适的氮源。当硫酸铵浓度达5 g/L后，随着浓度增加，降解率不再明显变化，说明该浓度为此刚果红降解菌的最大利用氮源量。表5　氮源投加量的优化结果 　　

4 结论 　　

本研究从长期受到偶氮废水污染的土壤中成功地分离出一株能够在厌氧条件下有效降解偶氮染料刚果红的菌株。经鉴定该菌株为克雷伯氏菌，并定名为Klebsiella sp.Y12。本研究优化了降解培养基的碳源及氮源。结果表明：最适于刚果红降解的碳源为葡萄糖，最适投加量为8.0 g/L;最适氮源为硫酸铵，最适硫酸铵投加量为5.0 g/L。且优化后的降解率达93%，比未优化前提高19%。